University of Kerbala
اسم الباحث : محمـود عثمان عباس الجنابي
اسم المشرف : أ. د. عدنان عبد الجليل لهوف
الكلمات المفتاحية :
الكلية : كلية الزراعة
الاختصاص : العلوم الزراعية علم وقاية النبات
سنة نشر البحث : 2022
تحميل الملف : اضغط هنا لتحميل البحث
الخـــلاصة
هدفت هذه الدراسة الى تحديد أنواع جنس Begomovirus وتوابعها المنتشرة على عدد من العوائل النباتية في محافظة كربلاء باستعمال التقنيات الجزيئية الحديثة مثل Polymerase Chain Reaction ، Realtime- Polymerase Chain Reaction واهم هذه الطرق هيNext Generation sequencing
جُمعت عينات مختلفة من نباتات الطماطة من محافظة كربلاء ظهرت عليها اعراض الإصابة الفايروسيه في موسم النمو 2021-2022، استخلص الحامض النووي الـ DNA باستعمال العدة التجارية وطريقة مبتكرة في هذه الدراسة هي استخلاص الحامض النووي بمادة هايبوكلوريت الصوديوم NaClO )القاصر) وطبقت تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل Polymerase Chain Reaction (PCR) باستعمال بادئات تستهدف تشخيص أنواع الجنس الفايروسي Begomovirus بالإضافة الى تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل اللحظي Realtime-PCR (RT-PCR) كما استعملت تقنية الجيل التالي لتحديد التسلسل Next Generation sequencing (NGS) بطريقة Metagenomicsفي تشخيص الفايروسات النباتية المرافقة للنباتات المصابة.
أظهرت النتائج نجاح الطريقة المبتكرة في استخلاص الـDNA الكلي من النباتات المصابة بفايروس TYLCV. وكانت طريقتي الاستخلاص باستعمال محلول هيدروكسيد الصوديوم لوحده او متبوعاً بتطبيق عملية ترسيب الـDNA افضل من طريقة استعمال الماء المقطر فقط او مع تطبيق عملية ترسيب الـDNA ومن جانب اخر حققت العدة التجارية التركيز والنقاوة الأعلى للـDNA المستخلص من النباتات المصابة نفسها.
أظهرت نتائج اختبار العينات النباتية المصابة باستعمال تقنية PCR نجاح زوج البادئات PBL1v2040-F و PAR1c496-R في الارتباط وتضخيم مناطق محددة من الحامض النووي الخاص ببعض انواع الجنس Begomovirus بالمقابل لم تنجح بقية البادئات المستعملة في هذا الاختبار في اكتشاف الفايروسات المحددة.
بالرغم من عدم نجاح عينات الـDNA لمحصولي البطاطا والباميا في أتمام عملية تحديد التسلسل لهما باستعمال تقنية الـNGS الا ان عينات محصول الطماطة نجحت اذ تم الحصول على 52,606,000 سلسلة مقروءات مزدوجة النهايات (Paired ends reads) باطوال 151 قاعدة نايتروجينية والتي تم إنشاؤها للحصول على بيانات الـ Metagenomics.
لقد أظهرت نتائج تقنية الـNGS وجود العديد من المتجاورات المتداخلة المشابهة للتسلسل المرجعي للجينوم الكامل لفايروس تجعد واصفرار أوراق الطماطة Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) اذ غطت تسلسلات الجينوم بأكمله لهذا الفايروس وكان مجموع طول تسلسل هذه المتجاورات 2729 قاعدة نايتروجينية التي نتج عنها جينوم ذو شريط مفرد حلقي احادي الجزء (Monopartite) وذو تنظيم جيني مطابقاً لسلالات هذا الفايروس وذلك باحتوائه على ستة جينات رئيسة مشفرة للبرويتنات الست الرئيسة للفايروس بالإضافة الى المنطقة الوراثية الغير مشفرة مابين الجينات (Intergenic region). ولقد تم أثبات العلاقة الوراثية بين تسلسل الجينوم الكامل لهذا الفايروس مع العديد من سلالات الفايروس نفسه تحديداً السلالات المعتدلة (Mild) وكانت العزلة Tomato yellow leaf curl virus isolate TYLCV-Najaf (MT583814.1) الأكثر تشابه بنسبه وصلت الى 99.30%. تم إيداع هذا الجينوم الكامل لهذه السلالة في قاعدة بيانات NCBI-GenBank بالاسم Tomato yellow leaf curl virus – Mild strain Karbala-1 وتحت الرمز ON254272.1. إذ اشارت نتائج الفحص والتحليل عن عدم وجود ظاهرتي إعادة التركيب وإعادة التجميع في جينوم فايروس TYLCV-Mld Karbala-1 المشخص في هذه الدراسة علما ان المتجاورات المتداخلة لسلالة الفايروس هذه كانت السائدة في حقول الطماطة التي شملها المسح. ويعد هذا التسجيل الأول لهذا السلالة في محافظة كربلاء، العراق.
بينت النتائج أيضا عدم وجود مقروءات او متجاورات متداخلة شبيه للتابعين ألفا و دلتا بينما كان هنالك 12,712 مقروءة و9 متجاورات غطت بشكل تام (100%) الجينوم الكامل لأحد توابع بيتا (satDNA β) وهو Cotton leaf curl Gezira betasatellite isolate Al-Ain (KM279620.1) وبنسبة تشابه 94.66% والذي تم تأكيده بنتائج تحليل النشوء والتطور لذلك حفظ الجينوم الكامل لهذا التابع في مستوعب NCBI-GenBank بالاسم Cotton leaf curl Gezira betasatellite isolate Karbala وتحت الرمز ON206651.1 ويعد هذا التسجيل الأول لهذا التابع في العراق.
كما بينت النتائج ان هنالك العديد من المتجاورات المتداخلة التي تتشابه مع القطعتين الأولى والثانية (Segment A و Segment B) من جينوم الفايروس Tomato leaf curl palampur virus ذو الجينوم ثنائي الأجزاء (Bipartite). كما لوحظ ان هذه المتجاورات تمتلك تنظيماً جينياً مطابقاً لجينوم هذا الفايروس اذ احتوت القطعة الأولى (Segment A) على ستة جينات رئيسة مشفرة لبرويتنات ستة رئيسة للفايروس بينما تضمنت القطعة الثانية (Segment B) جينين فقط تشفران لبروتينين بالإضافة الى احتواء القطعتين على مناطق غير مشفرة مابين الجينات (Intergenic region). وبالرغم من تسجيل ودراسة الإصابة بهذا الفايروس سابقاً في العراق على نباتات القرع و الداتورة و الخيار الأ ان تشخيصنا له في نبات الطماطة هو الأول على مستوى العراق.
لقد تم أيضا في هذه الدراسة تشخيص جينوم فيروس داخلي ضمن جينوم نبات الطماطة Solanum lycopersicum. اذ أشارت نتائج التشابه لمسودة الجينوم التي تم الحصول عليها الى ان الفايروس المشخص هو Tobacco vein clearing virus (TVCV) وبنسبه تشابه 87.4% مع نسبة تغطية 98.1 % كما اكدت نتائج تحليل التشابه والنشوء هذا التشخيص وقد تم التجميع النهائي لتسلسل جينوم TVCV المشخص في هذه الدراسة وايداعه ضمن بيانات بنك الجينات تحت الرمز ON684329 اذ كان ذو شريط DNA مزدوج طوله 7760 قاعدة نايتروجينية تتضمن أربعة أطر قراءة مفتوحة open reading frames أي جينات تشفر المناطق المحافظة النموذجية لجينوم أنواع الجنس Solendovirus التابع لها.
بالإضافة الى ذلك فقط تم الحصول على مسودة الجينوم الكامل لمايتوكوندريا حشرة الذبابة البيضاء المرافقة لنباتات الطماطة المصابة وذلك عن طريق تحديد وجود 14 جين مشفر للبروتينات Protein-coding genes (PCGs) مع وجود جينين للحامض النووي الرايبوسومي Ribosomal RNA genes للوحدة الكبيرة والصغيرة و22 جين من الحامض النووي الناقل Transfer RNA. واكدت هذه النتيجة ان نوع حشرة الذبابة البيضاء المنتشرة على محصول الطماطة في محافظة كربلاء هو Bemisia tabaci MEAM1. وأظهرت نتائج التشخيص الجزيئي باستعمال تفاعل البلمرة المتسلسل اللحظي Real Time-PCR ان البادرات الناميه من البذور المعقمة والبذور غير المعقمة كانت مصابة بالفايروس TYLCV مما يشير الى إمكانية انتقال هذا الفايروس بواسطة البذور.
Application of Next-generation sequencing in identification of Begomovirus species in Karbala Province on tomato plant
The aim of the current study was to identify the plant viruses belong to Begomovirus genus that infect a number of plant hosts in Karbala Province using the new molecular techniques.
Different viral symptomatic plant samples were collected from tomato plants of Karbala Province, okra plants from Babylon Province, and potato plants from Baghdad and Babylon Provinces in the growing season of 2021-2022. The DNA was extracted from these samples using a commercial kit and a developed extraction method. The Polymerase Chain Reaction (PCR) test was applied using specific primers that detect different species of Begomovirus genus in addition to Realtime-PCR (RT-PCR). Furthermore, the Next Generation Sequencing (NGS) technique, type Metagenomics was utilized to identify Begomoviruses accompanying with the infected plants.
The results showed that the new developed extraction method succeeded in extraction the total genomic DNA from TYLCV infected plants. The extraction method exploiting sodium hypochlorite (NaOCl) alone or followed by DNA precipitation process were better than using the distilled water alone or with DNA precipitation. However, the commercial extraction kit provided the highest concentration and purity of DNA extracted form same infected plants. Additionally, the primer pair (PBL1v2040-F and PAR1c496-R) succeed in amplification and detection of some Begomovirus species. On the other hand, the rest of primers did not success in detection of the Begomoviruses.
Although, the DNA samples of potato and okra plants failed in accomplishment of the NGS sequences, the tomato DNA samples success by obtaining 52,606,000 paired ends reads with length of 151 nt that were produced for the Metagenomics data. The results of NGS data proved existing several contigs that were similar or identical to the reference sequence of Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). They covered completely the full length of the viral genome and their consensus sequence size was 2729 nt. The genome produced was a single circular strand of monopartite DNA comprising the main six genes coding the main proteins of the TYLCV in addition to the non-coding intergenic region. Furthermore, the phylogenetic analysis confirmed the genetic relationship of the identified viral strain with many of global TYLCV mild strains particularly the Tomato yellow leaf curl virus isolate TYLCV-Najaf (MT583814.1). This full genome was deposited in the NCBI-GenBank data with name Tomato yellow leaf curl virus – Mild strain Karbala-1 under accession number ON254272.1. Moreover, the recombination and reassortment processes were not found in the genome of the TYLCV-Mld Karbala-1 identified in this study. The results also evidenced that this strain was the predominant TYLCV strain in the surveyed tomato fields. This identification is the first record in Karbala Province, Iraq.
Nevertheless, there was no raw reads or contigs similar to the Alpha or Delta satellites, it was discovered 12,712 raw reads and 9 contigs that were comparable and covered completely the full genome of the Beta satellite Cotton leaf curl Gezira betasatellite isolate Al-Ain (KM279620.1) with similarity percentage reached to 94.99%. This identification was confirmed through phylogenetic analysis. Thus, full genome of the Beta satellite obtained was saved in the NCBI-GenBank database under name Cotton leaf curl Gezira betasatellite isolate Karbala with accession number ON206651.1, which is considered also the first report to this satellite in Iraq.
As well as, the results revealed a numerous contigs that were similar to the Segment A and segment B of Tomato leaf curl palampur virus (ToLCPaLV) that was a single bipartite genome. These related contigs had genes organization identical to genome of ToLCPaLV by containing analogous six genes in the segment A and two genes in the segment B besides the intergenic regions in both segments. Although, this virus was identified previously on zucchini, datura and cucumber plants, this is first report of it infecting tomato plants in Iraq.
It was also found in this study the full genome of the endogenous pararetrovirus Tobacco vein clearing virus in the host genome of tomato (Solanum lycopersicum) with similarity percentage 87.4% and covered percentage 98.1%. This identification was confirmed through the phylogenetic analysis. Consequently, the consensus double strands DNA 7760 nt genome sequence was deposited in the NCBI-Genbank under accession number ON684329 with the same name.
In addition, the draft genome of the whitefly mitochondria was determined. This genome comprised 14 Protein-coding genes (PCGs), two ribosomal RNA genes and two genes of transfer RNA. This finding confirmed that the species of whitefly insect common in the Karbala Province, Iraq is Bemisia tabaci MEAM1. As well as, the results of RT-PCR confirmed that the seedlings growing from the sterilized and non-sterilized TYLCV infected tomato seeds were infected by same virus. This can refer to possibility of transmission of the TYLCV via seeds.
