إنتاج وتوصيف إنزيمي الكايتينيز وبيتا 3-1 كلوكانيز من الفطر Trichoderma fertile المعزول محلياً

2020-07-23

رسالة ماجستير

اسم الباحث : حوراء عباس حيدر

الكلية : كلية العلوم

الاختصاص : علوم الحياة

سنة نشر البحث : 2011

تحميل الملف : اضغط هنا لتحميل البحث

المشاهدات: 8

   أجريت هذه الدراسة لتحديد الظروف المثلى لإنتاج إنزيمي الكايتينيز وبيتا3-1 كلوكانيز من الفطر Trichoderma fertile المعزول محلياً كونهما من الإنزيمات الأساسية المسؤولة عن تحليل الجدران الخلوية للفطريات الممرضة (التي تتكون بصورة رئيسة من الكايتين وبيتا3-1 كلوكان) .

 كما شملت الدراسة تنقية جزئية للإنزيمين ودراسة بعض صفاتهما المهمة ، وأظهرت النتائج ما يأتي

  • بعد إجراء غربلة ل 25 عزلة فطرية تعود لأجناس مختلفة تم اختيار العزلة الأعلى إنتاجا للإنزيمين والتي شخصت فيما بعد على أنها Trichoderma fertile وأعطيت الرمز AH1 لتصبح fertile AH1، واستخدمت في مراحل الدراسة اللاحقة.
  • كانت الظروف المثلى لإنتاج الإنزيمين من العزلة المختارة في هذه الدراسة هي استخدام وسط مكون من خميرة الخبز بنسبة %1.5 المدعم ب 0.1 % من كل من فوسفات البوتاسيوم ثنائية الهيدروجين وكبريتات المغنيسيوم المائية برقم هيدروجيني ابتدائي 4.0 وحجم لقاح مقداره قرص واحد (106×5 سبور/مليلتر) والحضن في الحاضنة الهزازة بدرجة حرارة 30 م بسرعة رج 125 دورة /دقيقة ولمدة 96 ساعة.
  • تم تنقية الإنزيمين من الفطر fertile AH1 جزئياً وشملت خطوات التنقية الديلزة فالترسيب بالايثانول (%70- 20) ثم التبادل الأيوني باستخدام المبادل DEAE-Cellulose حيث أسفرت الخطوة الأخيرة عن ظهور صورتين إنزيميتين (A و B) لإنزيم الكايتينيز فضلاً عن صورة إنزيمية واحدة لإنزيم بيتا 3-1 كلوكانيز ، وبلغ عدد مرات التنقية (2.22 و 0.27 و 2.55) مرة بحصية إنزيمية (31.49 و 3.18 و 35.96)% لصورتي إنزيم الكايتينيز (A و B) وإنزيم بيتا 3-1 كلوكانيز على التوالي .
  • بعد توصيف صورتي إنزيم الكايتينيز (A و B) وإنزيم بيتا 3-1 كلوكانيز ، أظهرت النتائج ما يأتي :
  • بلغت قيمة ثابت ميكالس Km)) والسرعة القصوى (Vmax) (0.4 و 0.37) ملي مولر و (1.5 و 1.4) مايكرومول/مليلتر/دقيقة لصورتي إنزيم الكايتينيز (A و B) عل التلوالي حيال مادة التفاعل (pNP-GlcNAc) p-Nitrophenyl N-acetyl -D-glucosaminide، بينما بلغت قيمة Km و Vmax لإنزيم بيتا 3-1 كلوكانيز (111) مايكروغرام/مليلتر و (0.09) مايكرومول/مليلتر/دقيقة على التوالي حيال اللامينارين كمادة تفاعل .
  • كانت الأرقام الهيدروجينية (5.0 و 5.5 و 4.5) هي المثلى لفعالية صورتي إنزيم الكايتينيز (A و B) وإنزيم بيتا 3-1 كلوكانيز على التوالي ، في حين تراوح الرقم الهيدروجيني للثبات بين (7.5-3.5) و (7.5-4.5) و (7.0-3.5) للصورتين (A و B) لإنزيم الكايتينيز وإنزيم بيتا 3-1 كلوكانيز على التوالي .
  • أظهرت الصورتان (A و B) لإنزيم الكايتينيز ثباتاً حرارياً بين (40-20) مº و(55-20) مº لمدة 30 دقيقة على التوالي، بينما كان الثبات الحراري لإنزيم بيتا 3-1 كلوكانيز بين (45-20) مº وللمدة نفسها.
  • أدى استخدام بعض الأيونات المعدنية والمواد الكيميائية بالتركيزين (1 و 5) ملي مولر إلى تثبيط فعالية صورتي إنزيم الكايتينيز وإنزيم بيتا 3-1 كلوكانيز ولكن بدرجات متفاوتة ، بينما كان لكلوريد المنغنيز (MnCl2) تأثيرا حاثا لفعالية الإنزيمين فضلاً عن كلوريد الحديد (FeCl2) الذي كان له تأثيرا حاثاً أيضاً ولكن لفعالية صورتي إنزيم الكايتينيز فقط .
  • تضمنت هذه الدراسة أيضا بيان دور الآلية الإنزيمية في تثبيط نمو الفطريات الممرضة للنبات المتمثلة بــ Fusarium solani و Fusarium oxysporum و Rhizoctonia solani و الفطر Aspergillus flavus المنتج للسم افلاتوكسين (Aflatoxin)) وذلك باستعمال الراشح الخام للإنزيمين بتراكيز مختلفة ، وبيّنت النتائج أن للإنزيمين فعالية مثبطة واضحة ضد الفطريات المذكورة بنسبة %100 عند التركيز (1 : 1) من (الإنزيم : الوسط ) .

Production and Characterization of Chitinase and β 1-3 Glucanase from Trichoderma fertile Local Isolate

   This study was carried out to investigate the optimal conditions for Chitinase and β 1-3 glucanase production from the local isolate Trichoderma fertile , being the essential enzymes responsible for fungal cell wall lysis of pathogenic fungi (which consists mainly of chitin and β 1-3 glucan) .
The study also included a partial purification of both enzymes and characterization of some important properties , and the results showed the following :
1- 25 fungal isolates belong to different genes were screened for both enzymes production . Out of these isolates , an isolate identified as Trichoderma fertile AH1 was the most efficient in both enzymes production , and to be used in this study .
2- The optimal condition for both enzymes production from the selected isolate in this study were using medium composed of baker’s yeast at concentration 1.5 % supplemented with 0.1 % from
each of KH2PO4 and MgSO4.7H2O , at initial pH 4.0 with an inoculum size of one disc (2.5 × 106 spore / ml) , and incubated at 30 ˚C on a rotary shaker at 125 rpm for 96 h.
3- Chitinase and β 1-3 glucanase , from culture filtrates of T. fertile
AH1 , were partially purified by dialysis , precipitation with (20-70)% ethanol and DEAE-Cellulose ion exchange chromatography . Two Chitinase forms (A and B) were detected after ion exchange chromatography , while only one was detected for β 1-3 glucanase .
4- The two Chitinase forms (A and B) and β 1-3 glucanase were characterized . The results showed the following :
A- The Km and Vmax values for the two Chitinase form (A and B) , using pNP-GlcNAc as substrate , were (0.4 and 0.37) mM and (1.5 and 1.4) μmol/ml/min , respectively . While the Km and Vmax values for β 1-3 glucanase , using laminarin as substrate , were (111) μg/ml and (0.09) μmol/ml/min , respectively too .
B- The optimum pH for the two Chitinase forms (A and B) and β 1-3 glucanase activity were pH (5.0 , 5.5 and 4.5) , respectively , and were stable in the pH range of (3.5-7.5) , (4.5-7.5) and (3.5-7.0) , respectively too .
C- The two Chitinase forms (A and B) showed heat stability at (20-40) ˚C and (20-55) ˚C for 30 min , respectively . While the heat stability for β 1-3 glucanase was (20-45) ˚C for the same period of time .
D- Some of the metal ions and chemicals at (1 and 5) mM concentration showed different inhibition percentages on the two Chitinase forms (A and B) and β 1-3 glucanase activity. While manganese chloride had stimulated effect for both enzymes activity as well as iron chloride , which had also stimulated effect , but only for the two Chitinase forms activity .
5- This study also indicated the role of enzymatic mechanism in inhibition growth of plant pathogenic fungi such as Fusarium solani , Fusarium oxysporum , Rhizoctonia solani and Aspergillus flavus (Aflatoxin producer) , by using crude filtrate for Chitinase and β 1-3 glucanase with different concentrations and the results showed that both enzymes had clear inhibition activity against mentioned fungi by 100 % at concentration (1 : 1) (enzyme : media) .