University of Kerbala
اسم الباحث : زهراء اياد علي
اسم المشرف : أ.م. د. زينب نزار جواد
الكلمات المفتاحية :
الكلية : كلية التربية للعلوم الصرفة
الاختصاص : علوم الحياة
سنة نشر البحث : 2024
تحميل الملف : اضغط هنا لتحميل البحث
هدفت الدراسة الحالية وألتي استمرت لمدة تسعة أشهر إلى تقييم دور الكيتوسان النانوي Nano chitosan المحمل بالأمبسلين Ampicillin وَ الأسيتامينوفين Acetaminophen وَ حمض الميفانميك acid Mefenamic و السيفالكسين Cephalexin في تنشيط جين Tumer protein 53 (TP53) لتفعيل مسار الموت المبرمج Apoptosis في خط خلايا سرطان الكبد البشري Hepatocellular carcinoma (HepG2) خارج الجسم الحيin vitro .
تضمنت الدراسة الحالية الكشف عن فعالية تحميل الكيتوسان النانوي بـ الأمبسلين Ampicillin والسيفالكسين Cephalexinوهما من المضادات الحيوية فئة بيتا-لاكتام antibiotics Beta-lactam بالإضافة إلى حمض الميفانميك acid Mefenamic وهو من مضادات الإلتهابات غير الستيرويدية Nonsteroidal anti-inflammatory وَ الأسيتامينوفين Acetaminophen الذي هو مسكن للألم وخافض حرارة و بواسطة جهاز Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) فكانت ترددات المجاميع الوظيفية الفعالة للعقاقير النانوية ضمن المدى القياسي، وَ حُددت مواقع الأرتباط بين العقاقير والأحماض الأمينية لبروتين Protein 53 (p53) بواسطة أستخدام تقنية Molecular docking فارتبطت العقاقير في المواقع الفعالة التي تنشط p53.
ايضاً أجري أختبار (MTT) 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide للكشف عن السمية الخلوية للعقاقير النانوية في خط خلايا سرطان الكبد البشري HepG2 حيث عوملت الخلايا بتراكيز نصفية متزايدة للعقاقير النانوية (12.5،50.25،100،200،400 ميكغم/مل( ولمدة 72 ساعة تلاهُ إضافة 28 ميكرو لتر من صبغة MTT، أما نتائج هذا الأختبار فقد وضحت التأثيرات الفعالة للعقاقير النانوية وبالأعتماد على الجرعة حيث قلت حيوية الخلايا كلما ازدادت الجرعة، واعتماداً على Inhiation concentration (IC50) كان السيفالكسين الأكثر فعالية (59.07 ميكغم/مل) تلاهُ الأمبسلين (69.09 ميكغم/مل) ثُمَ حمض الميفانميك (65.44 ميكغم/مل) وَ أخيراً الاسيتامينوفين (73.88 ميكغم/مل ).
أظهرت نتائج أختبار الكشف عن التغيرات الشكلية Morphological changes بأستخدام صبغة Crystal violetفي خط خلايا سرطان الكبد البشري HepG2 المعرضة للعقاقير المحملة على الكيتوسان النانوي وبتركيز (Half-maximal inhibitory concentration (IC50 لكل عقار ولمدة 24 ساعة التغيرات المظهرية المصاحبة للمراحل الأولى للموت المبرمجApoptosis مثل تلف الغشاء الخارجي، أما علامات الموت المبرمج النهائية فقد تم الكشف عنها بإجراء أختبار ثنائي الصبغة بأستخدام صبغتي الإثيديوم بروميد وَ الأكردين البرتقالي (AO/EtBr) Acridine orange and ethidium bromide فاصطبغت الخلايا السرطانية السليمة وغير المعاملة بالعقاقير المحملة على الكيتوسان النانوي باللون الأخضر لـ Acridine orange التي تصبغ الحمض النووي للخلايا السليمة، أما الخلايا المعاملة بالعقاقير النانوية أصطبغت باللون البرتقالي لـ Ethidium bromide التي تصبغ الحمض النووي للخلايا الميته والتي تلف غشائها.
بينت نتائج أختبار quantitate Reverse Transcription Polymerase Chane (qRT-PCR) أرتفاع التعبير الجينيGene expiration لـ جين Tp53 في خط خلايا سرطان الكبد البشري HepG2 وكان السيفالكسين الأكثر تأثيراً حيث كان التعبير الجيني في الخلايا السرطانية التي عُرضت له (0.2603+3.233) تلاه الاسيتامينوفين (0.1764+3.233) ثُمَ حمض الميفانميك (0.1202+2.867) واخيراً الأمبسلين (0.2082+2.400) مقارنةً مع مجاميع السيطرة والتي لم تعامل بالكيتوسان المحمل بالعقاقير (0.0+1.000) مما يبين كفاءة العقاقير المحملة على الكيتوسان في تنشيط p53 وتفعيل مسار الموت المبرمج في خط خلايا سرطان الكبد البشري HepG2.
Effect of some drugs loaded on nano chitosan on human liver cancer HepG2 cell line in vitro
In the current work, which lasted for nine months an ex vivo human hepatocellular carcinoma (HepG2) cell line was used to assess the function of nano chitosan loaded with ampicillin, acetaminophen, mefenamic acid, and cephalexin in activating the Tumer protein 53 (TP53) gene to trigger the apoptotic pathway. The purpose of the current study was to determine how well beta-lactam antibiotics, such as Ampicillin and Cephalexin, work when loaded into chitosan nanoparticles along with nonsteroidal anti-inflammatory drug Mefenamic acid and painkiller and antipyretic acetaminophen. The drugs were bound to the active sites that activate Protein 53 (p53) after the molecular docking technique identified the binding sites between the drugs and the amino acids of p53. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) confirmed that the frequencies of the functional groups of the nanoparticles were within the standard range. To find out how cytotoxic nanomedicines were to human liver cancer cell line HepG2, another test known as the (MTT) 3-(4,5-dimethylimidazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide test was used. The cells were exposed to increasing half-concentrations of nanomedicines (12.5, 50.25, 100, 200, and 400 mg/ml) for 72 hours before 28 μl of MTT dye was added. The test’s findings demonstrated how effective nanomedicines can be dose-dependently since increasing doses caused a drop in cell viability. Cephalexin (59.07 ug/ml) was the most effective antibiotic based on the Inhibition concentration (IC50), followed by ampicillin (69.09 ug/ml), mefenamic acid (65.44 ug/ml), and acetaminophen (73.88 ug/ml).
The human liver cancer cell line HepG2 was exposed to drugs loaded on nano chitosan at a concentration of IC50 for each drug for 24 hours. The results of the test to detect morphological changes using Crystal violet dye showed phenotypic changes accompanying the early stages of apoptosis, such as
damage to the outer membrane, while the final signs of apoptosis were detected by performing a dual-stain test with the dyes Acridine orange and ethidium bromide (AO/EtBr). Acridine orange, which stains DNA in healthy cells, was used to stain the green cancer cells that were not treated with medications placed on nano chitosan. On the other hand, the cells treated with nano pharmaceuticals were stained orange with Ethidium bromide, which stains the DNA of dead cells whose membranes were damaged.
The human liver cancer cell line HepG2 showed increased Tp53 gene expression according to the results of the quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain (qRT-PCR) test. Cephalexin was the most effective drug, as shown by the gene expression in the exposed cancer cells (0.2603 + 3.233), followed by acetaminophen (0.1764), mefenamic acid (0.1202 + 2.867), and ampicillin (0.2082 + 2.400) in comparison to the control groups that were not treated with chitosan loaded with drugs (0.0 + 1.000). This indicates the effectiveness of drugs loaded on chitosan in activating p53 and initiating the programmed death pathway in the human liver cancer cell line HepG2.
