اسم الباحث : وسن رضا حسن محمد الشكرچي
اسم المشرف : أ.د. ياسمين خضير خلف الغانمي : أ.د. هيام عبد الرضا كريم العواد
الكلمات المفتاحية :
الكلية : كلية التربية للعلوم الصرفة
الاختصاص : علوم الحياة/علم الحيوان
سنة نشر البحث : 2025
تحميل الملف : اضغط هنا لتحميل البحث
الدراسة الحالية تضمنت عزل وتشخيص بكتريا Bifidobacterium bifidum والتعرف على مدى قدرتها في إنتاج المشتت الحيوي السطحي Biosurfactan ((BS، واستخلاص المشتت الحيوي السطحي منها والتحري عن تأثيره في خط خلايا سرطان القولون والمستقيم (Human Rectal Tumor) [HRT-18]، ثم التحري عن التعبير الجيني لجين NADPH Oxidase 4 gene (NOX4) لنفس الخط الخلوي بعد معاملته بالتراكيز المختلفة من المشتت الحيوي السطحي المستخلص ومقارنة تأثير هذه التراكيز مع تأثير العلاج الكيميائي FOLFOX.
إجريت الدراسة الحالية في الفترة الممتدة من بداية شهرنيسان 2024 وحتى نهاية شهركانون الثاني2025 وقد تضمنت ثلاثة محاور أساسية ، المحورالأول عزل وتشخيص البكتريا واستخلاص المشتت الحيوي السطحي منها في مركز الأمين للأبحاث / العتبة العلوية المقدسة ، وفي مركز ابحاث التقنيات الإحيائية / جامعة النهرين ، ومركز مختص بالدراسات الطبية في محافظة بغداد ، المحور الثاني فحوصات السمية الخلوية Cytotoxicity والمحور الثالث التحري عن التعبير الجيني لجين (NOX4) تم إجراؤهما في جامعة ملايا كلية الطب/قسم الصيدلة مركز التحري عن العلاجات الجديدة في ماليزياCenter for Natural Product Research and Drug Discovery, Department of pharmacology, faculty of Medicine University of Malaya , Kuala Lumpur .
تم عزل وتشخيص خمسة عزلات من بكتريا B. bifidum من مصادر مختلفة والتحري عن قدرة البكتريا في إنتاج المشتت الحيوي السطحي، ثم استخلاص المشتت الحيوي السطحي وتجفيدة بجهاز Lyophilizer، ثم حُضرت خمسة تراكيز من (BS) وهي (25، 50، 100، 200، 400) مايكروغرام/مل
تم الكشف عن التأثيرات السمية الخلوية باستخدام فحص [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay (MTT) تم تعريض الخلايا السرطانية بعد تنشيطها للتراكيز الخمسة المحضرة لمدة 24 ساعة وبدرجة حرارة 37م° ، وأظهرت النتائج وجود تأثيرات سمية خلوية للـ (BS) على خط خلايا [HRT-18] إذ لوحظ انخفاض في عدد الخلايا السرطانية مع زيادة في نسبة معدل التثبيط بزيادة التركيزات حيث وصلت اعلى نسبة تثبيط عند التراكيز (200,400) مايكروغرام/مل وقد بلغت النسب (68.4,61.3) %على التوالي في حين لم يظهر(BS) سمية خلوية حادة على الخلايا الطبيعيHuman Dermal Fibroblasts, neonatal (HDFn) وأظهرت النتائج فروقاً معنوية (P ≤ 0.0001) في حساب الحد المثبط النصفيInhibitory Concentration 50% (IC50)عند معاملة الخلايا السرطانية [HRT-18] بالـ(BS) حيث بلغ (53.4) مايكروغرام/مل ، وفي خط الخلايا الطبيعية HDFnقد بلغ (93.2) مايكروغرام/مل .
وقد أكدت النتائج وجود فروقاً معنوية (P ≤ 0.0001) بين (BS) والعلاج الكيميائيFOLFOX في الخط الخلوي السرطاني [HRT-18] بالتراكيز بين (25 , 400) مايكروغرام/مل ، بينما أظهرت النتائج وجود فروقاً معنوية بين (BS) وFOLFOX في الخط الخلوي الطبيعي HDFn بالتراكيز(200,400) مايكروغرام/مل ولم تظهر أي فروقاً معنوية بالتراكيز (25 , , 50 100) مايكروغرام/مل.
وعلى ضوء نتائج MTT تم أجراء فحص High Content Screening (HCS) لتقييم السمية الخلوية وتضمنت النتائج قياس عدة مؤشرات خلوية ، وذلك من خلال الكشف عن التغيرات التي تطرأ على الخط الخلوي السرطاني [HRT-18] بأستخدام التراكيز(25 ، 50 ، 100 ، 200) مايكروغرام/مل من الـ (BS) وتم مقارنة جميع المعاملات مع السيطرة السالبة (الخلايا غير المعاملة Untreated) والسيطرة الموجبة (العلاج الكيميائي FOLFOX) بتركيز(200) مايكروغرام/مل ، حيث أكدت نتائج الفحص (HCS) وجود تأثيرات معنوية على معظم المؤشرات الخلوية بزيادة تركيز الـ (BS) على الخط الخلوي السرطاني [HRT-18] وخاصتاً في التراكيز(100،200) مايكروغرام/مل مقارنة مع السيطرة السالبة و أوضحت النتائج عدم وجود فرق معنوي بين تأثير الـ (BS) و FOLFOX بالتركيز (200) مايكروغرام/مل.
وأظهرت نتائج فحص Caspase-9 and Caspase-8 إن Caspase 9 قد أظهر زيادة معنوية مقارنةً بالسيطرة السالبة وكانت هذه الزيادة معتمدة على التراكيز التي تتراوح بين (25 ، 200) مايكروغرام/مل ، بينما Caspase 8 أظهر نشاط أقل مقارنة مع Caspase 9 ، مما يشير إلى أن المسارالأساسي في عملية الموت المبرمج هو المسار الداخلي والمسؤول عنه Caspase 9 ، وأظهرت النتائج عدم وجود فروق معنوية بين تأثير(BS) وFOLFOX بالتركيز (200) مايكروغرام/مل مقارنةً بالسيطرة السالبة في كلا المسارين
وأظهرت نتائج فحص 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Anti-Oxidant Activity عدم وجود فروق معنوية بين (BS) وAscorbic acid عند معاملتهما مع الخط الخلوي [HRT-18] مع وجود فرق معنوي ضئِيل في تركيز (50) مايكروغرام/مل.
كما وأظهرت نتائج فحص مركبات الأوكسجين التفاعليةReactive Oxygen Species (ROS) عن وجود فروق معنوية وزيادة في إنتاج ROS في التراكيز (100200,) ميكروغرام/مل، وأظهرت النتائج
عدم وجود فروق معنوية بين تأثير (BS) وFOLFOX بتركيز (200) مايكروغرام/مل مقارنةً بالسيطرة السالبة.
وأظهرت نتائج التحري عن التعبير الجيني لجين (NOX4) في الخط الخلوي [HRT-18] بعد معاملته بتراكيز مختلفة من (BS) باستخدام فحصQuantitative Reverse Transcription Real-Time PCR (RT- qPCR) ، إن (BS) له تأثيرات سمية خلوية مع وجود فروقاً معنوية P≤ 0.0001في التعبير الجيني لجين (NOX4 ) في الخط الخلوي [HRT-18] بعد معاملتها بالتراكيز (200 ، 400) ميكروغرام/مل مقارنةً بالسيطرة السالبة ، بينما في التراكيز (100،50،25) ميكروغرام/مل لم تظهر أي فروقاً معنوية في التعبير الجيني ، أي انه بالتراكيز العالية من الـ (BS) يزداد التعبير الجيني لجين(NOX4) و كلما انخفض التركيز يقل التعبير الجيني لجين(NOX4) المضاد للسرطان.
Effect of Bifidobacterium bifidum Biosurfactant on HRT-18 Cancer Cell Line and Investigation of Gene Expression of NOX4
The current study involved the isolation and identification of Bifidobacterium bifidum and the evaluation of its ability to produce a Biosurfactant (BS). The (BS) was subsequently extracted and its effect was investigated on the Human Rectal Tumor cell line [HRT-18]. Then, the study assessed the gene expression of the NADPH Oxidase 4 gene (NOX4) in the same cell line following treatment with various concentrations of the extracted (BS), and the effects of these concentrations were compared to the chemotherapeutic FOLFOX.
The current study was conducted from the beginning of April 2024 to the end of January 2025 and included three main axes, the first axis was the isolation and diagnosis of bacteria and extraction of (BS) at the Al-Ameen Research Center/The Holy Shrine of Imam Ali (AS) Najaf/Iraq, the Biotechnology Research Center/Al-Nahrain University, and a specialized medical studies center in Baghdad/Iraq The second component focused on cytotoxicity Assays, while the third involved investigating the gene expression of NOX4. The latter two components were carried out at the Center for Natural Product Research and Drug Discovery, Department of Pharmacology, Faculty of Medicine, University of Malaya, Kuala Lumpur.
Five B. bifidum isolates were obtained and screened for (BS) production. The extracted )BS( was lyophilized, and five concentrations (400, 200, 100, 50, 25( µg/ml were prepared.
Cytotoxic effects were detected using the [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay (MTT) , activated cell line [HRT-18] were exposed to the five prepared concentrations for 24 hours at 37C°, the results showed cytotoxic effects of (BS) on the [HRT-18], a decrease in the number of cancer cells was observed with an increase in the inhibition rate with increasing concentrations, with the highest inhibition rate at concentrations (400,200) μg/ml reaching (68.4, 61.3)% respectively.
While (BS) did not show acute cytotoxicity on the normal cells Human Dermal Fibroblasts neonatal [HDFn], the results showed significant differences P≤0.0001 in the calculation of the Inhibitory Concentration 50% (IC50) when cancer cells [HRT-18] were treated with (BS) 53.4 μg/ml, and in [HDFn] 93.2 μg/ml.
The results confirmed significant differences P≤0.0001 between (BS) and FOLFOX in the [HRT-18] at concentrations between (400, 25(µg/ml, while the results showed significant differences between (BS) and FOLFOX in [HDFn] at concentrations (400, 200)µg/ml and no significant differences at concentrations (100, 50, 25)μg/ml.
Based on MTT results, High Content Screening (HCS) was conducted on [HRT-18] cells using (BS) concentrations between (200, 25)µg/ml, with comparisons to untreated cell controls and (FOLFOX) 200 µg/ml.
The results of the (HCS) confirmed significant effects on most cellular indicators with an increase in the concentration of the (BS) on the [HRT-18], particularly at concentrations of (200, 100)µg/ml , compared to the negative control , the results also indicated no significant difference between the effects of (BS) and FOLFOX at a concentration of 200µg/ml.
The results of the Caspase-9 and Caspase-8 assays showed that Caspase-9 exhibited a significant increase compared to the negative control, on the other hand, Caspase-8 showed lower activity, compared to Caspase-9, suggesting that the main pathway in the opoptosis is the intrinsic pathway, mediated by Caspase-9. Moreover, the results revealed no significant differences between the effects of the (BS) and the FOLFOX at the concentration of 200µg/ml, when compared to the negative control in both apoptotic pathways.
The results of the 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) anti-Oxidant assay showed no significant differences between (BS) and Ascorbic acid when treated the [HRT-18] cell line with a small significant difference at a concentration of 50µg/ml.
The results of the Reactive Oxygen Species (ROS) assay showed that there were significant differences and an increase in ROS production at concentrations (200, 100)µg/ml, and the results showed no significant differences between the effect of )BS( and FOLFOX at a concentration of 200μg/ml, compared to the negative control.
The results of the investigation of the gene expression of NOX4 gene in the [HRT-18] after treating it with different concentrations of (BS) using the Quantitative Reverse Transcription Real-Time PCR (RT-qPCR) assay showed , (BS) has cytotoxic effects with significant differences P≤0.0001 in the gene expression of NOX4 gene in the [HRT-18] after treatment with concentrations (200,400)µg/ml, compared to the negative control, while at concentrations (100, 50, 25)µg/ml no significant differences appeared in gene expression, meaning that with increasing concentrations of (BS), the gene expression of the anti-cancer NOX4 gene increases.
