اسم الباحث : زينب عبد الامير مزهر احمد
اسم المشرف : أ.د. لقاء حسون صكبان
الكلمات المفتاحية :
الكلية : كلية التربية للعلوم الصرفة
الاختصاص : علوم الحياة/علم الحيوان
سنة نشر البحث : 2025
تحميل الملف : اضغط هنا لتحميل البحث
الخلاصة:
أُجريت هذه الدراسة خلال الفترة من شهر شباط 2024 ولغاية شهر كانون الثاني 2025 في شركة روافد العلوم للتدريب والتطوير البحثي ومختبر UGENE في محافظة بابل ، تم الكشف الكيميائي الكمي عن المجاميع الفعالة لجذور نبات Withania somnifer باستخدام تحليل High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ، اظهرت نتائج تحليل (HPLC) وجود المجاميع فعالة في مستخلص جذور نبات الأشواغندا شملت كل من القلويدات والكلايكوسيدات والتربينات والعناصر المعدنية بنسب اقل مقارنة مع المركبات الفينولية والفلافونيدات التي كانت بنسب عالية حيث بلغت نسبتها ( 198.0) و(114.5 ) mg / 100 gm على التوالي .وكذلك كانت نتائج تحليل) (AAS Atomic Absorption Spectroscopy للعناصر الفعالة تشمل ( Fe,Cu, Mg , Zn and Mn ) توجد في النبات .
شملت الدراسة الحالية محورين الأول تضمن تقييم الفعالية السمية الخلوية للمستخلص المائي و الكحولي لجذور نبات الأشواغندا Withania somnifera لنمو خلايا خط سرطان القولون البشري Sw480)) ولفترة تعريض 48 ساعة خارج الجسم الحي In vitro وبالمقارنة مع تأثير عقار السسبلاتين Cisplatin بواسطة اختبار (MTT) 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay) على خلايا سرطان القولون البشري Sw480)) ، كما تم دراسة الفعل المشترك للمستخلصات جذور نبات الأشواغندا المائية والكحولية مع عقار Cisplatin بتركيز (15.6 µg/ ml) على النسبة المئوية لحيوية خلايا Sw480)) ولفترة تعريض 48 ساعة ، المحور الأخر من الدراسة شمل حساب التعبير الجيني لكل من جين P53 و PIK3CA لخلايا سرطان Sw480)) بعد تعريضها للمستخلص المائي والكحولي لجذور نبات الأشواغندا لمدة 48 ساعة ، كذلك تقدير التعبير الجيني لجين P53 و PIK3CA لخلايا سرطان Sw480)) بعد تعريضها لمزيج من المستخلص المائي والكحولي لجذور نبات الأشواغندا وعقار Cisplatin لمدة 48 ساعة .
تم قياس التأثير السمي الخلوي للمستخلص المائي والكحولي الأثيلي (70%) لجذور نبات الأشواغندا باستخدام ستة تراكيز نصفية (1000,500, 250, 125, 62.5, 31.2 µg/ ml) ، أوضحت النتائج وجود أعلى نسبة مئوية للحيوية Inhibition Rate (IR) لخلايا سرطان القولون Sw480)) عند تعرضها للمستخلص المائي والتي بلغت 24.61% وبمستوى معنوي (P≤0.01)قياساً بالسيطرة (الخلايا غير المعاملة بالمستخلص) ((100.00 ±2.15. أما عند معاملة الخلايا بالمستخلص الكحولي الذي كانت أكثر فعالية في تثبيط نمو الخلايا السرطانية ووصــــلت النسبة المئوية لحيوية الخلايـــــا سرطـــــان القولون Sw480)) الى (9.91 ±0.39)% عند التركيز ml) / (1000 µg أي النسبة المئوية للحيوية بلغت ( (90.09 وبمستوى معنوي عالي ( (P≤0.01 عن التراكيز الأخرى المستخدمة ومعاملة السيطرة (100.00 ±2.15).
عند معاملة خلايا Sw480)) بعقار Cisplatin حيث لوُحظ أن للعقار تأثير كبير على حيوية الخلايا السرطانية الــ Sw480)) ولكافة التراكيز المستعمـــــلة وبفترة تعريض 48ساعة وبفــــارق معنـــــوي (P ≤ 0.01) حيث وصلت النسبة المئوية لحيوية الخلايا Sw480)) إلى 39.16 ±2.50)) % عند أعلى تركيز مستعمل 1000 µg/ml في حين بلغت النسبة المئوية لحيوية خلايا Sw480)) %(18.24 ±1.44) عند أقل التركيز ( µg/ml 31.25 ) وهناك اختلاف تدريجي طفيف لحيوية الخلايا ما بين التراكيز الأخرى.
اظهرت نتائج الدراسة الجزيئية التي تضمنت قياس مستوى التعبير الجيني لـــ PIK3CA لخلايا Sw480)) عند معاملتها بالمستخلص المائي لجذور نبات الأشواغندا لمدة 48 ساعة ،إذ ظهرت زيادة معنوية وبلغت قيمة التعبير الجيني (363.3± 3.561) %عند أقل التراكيز المستخدمة (31.25 µg\ml) مقابل 1.000± 0.0)) % قيمة التعبير الجيني لجين السيطرةGAPDH ، أما عند قياس مستوى التعبير الجيني لــ P53 عند معاملة خلايا سرطان القولون البشري Sw480)) بالمستخلص المائي لجذور نبات الأشواغندا والذي وصلت إلى (0.9642 98.36±)% عند التركيز (31.25 µg\ml) مقابل 1.000±0.0% )) قيمة التعبير الجيني لجين السيطرة GAPDH
اما عند استخدام المستخلص الكحولي فأشارت النتائج ان أعلى نسبة لمستوى التعبير الجيني لـــ PIK3CA في خلايا Sw480)) بلغ (363.3 ± 3.561 )% عند التركيز (31.25 µg\ml ) وعند مستوى معنوية عالية ( P≤0.0001) ، في حين سجلت أعلى نسبة للتعبير الجيني عند نفس المستخلص للجين P53 والتي بلغت (1.281 ± 130.7)% عند التركيز (1000 μg/ml) عند مستوى معنوية (P≤0.0001) مقابل 1.000± 0.0)) % قيمة التعبير الجيني لجين السيطرة GAPDH.
بينت نتائج التعبير الجيني لــ PIK3CA عند معاملة خلايا سرطان القولون البشري Sw480)) بعقار Cisplatin بتركيز 15.6 µg/ ml اذ وصلت كانت اعلى نسبة للتعبير الجيني إلى (%(100.1 ± 0.9810 في حين ظهر أعلى مستوى لقيمة التعبير الجيني لجين الـــ P53 عند معاملة الخلايا بعقار Cisplatin كانت (299.2± 4.400 )% عنـــد التركيز ( (62.5 μg/ml وعنـــــد مستــــوى معنــــوية (P ≤0.0001) .
كشفت نتائج الفعل المشترك بين المستخلص المائي لجذور نبات الشواغندا مع عقار Cisplatin بتركيز ( (15.6 μg/ml أن أعلى نسبة للتعبير الجيني لـــ PIK3CA بلغت (0.9313 ± 190.0)% عند التركيز (1000 μg/ml ) في حين كان الفعل المشترك بين المستخلص المائي وعقار الـــ Cisplatin أعطى أعلى نسبة للتعبير الجيني لـــ P53 (200.9 ± 1.969 )% عند التركيز (250μg/ml) . اما نتائج المستخلص الكحولي مع عقار الــ Cisplatinكانت أعلى نسبة للتعبير الجيني لــ PIK3CA (4.635 ± 236.4)% عند التركيز (62.5 μg/ml) ، أما جين P53 فكانت أعلى نسبة للتعبير الجيني هي (319.6±6.265)% عند التركيز ) (250µg\ ml عند مستوى معنوية (≤ 0.0001 P) مقابل 1.000± 0.0)) % قيمة التعبير الجيني لجين السيطرة GAPDH.
مما تقدم في الدراسة نستنتج أن المركبات الفعالة في جذور نبات الشواغندا Withania somnifera للمستخلص المائي والكحولي جعلت من النبات ذو سمية خلوية واضحة وكبيرة على خلايا خط سرطان القولون البشري Sw480)) وعلى النسبة المئوية لمستوى التعبير الجيني لكل من PIK3CA وP53 ، بالإضافة الى الفعل المشترك للمستخلصات النبات المائية والكحولية مع عقار Cisplatinوالذي كان جعل من العقار يعطي نتائج افضل للسمية أتجاه خلايا Sw480)) بوساطة كل من النسبة المئوية لحيوية الخلايا أو مستوى التعبير الجيني لــ PIK3CA و P53
Evaluation of the cytotoxic and molecular effects of Withania somnifera L. aqueous and alcoholic root extracts and cisplatin on the gene expression of p53 and PIK3CA genes in SW480 colon cancer cell line in in vitro
Summary
This study was conducted during the period from February 2024 to January 2025 at Rawafed Al-Ulum Company for Training and Research Development and UGENE Laboratory in Babylon Governorate. The quantitative chemical detection of the active components of Withania somnifera roots was performed using High Performance Liquid Chromatography (HPLC). The HPLC analysis results showed the presence of active components in the Withania somnifera root extract, including alkaloids, glycosides, terpenes, and mineral elements at lower levels compared to phenolic compounds and flavonoids, which were at high levels, reaching (198.0) and (114.5) mg/100 gm, respectively. The results of the AAS Atomic Absorption Spectroscopy analysis also showed the presence of active components in the plant, including (Fe, Cu, Mg, Zn, and Mn). The current study included two axes: the first included evaluating the cytotoxic activity of the aqueous and alcoholic extracts of the plant roots Withania somnifera on the growth of human colon cancer cell line Sw480 cells for an exposure period of 48 hours in vitro and compared with the effect of Cisplatin by 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay (MTT) on human colon cancer cells Sw480. The combined effect of aqueous and alcoholic extracts of Withania somnifera roots with Cisplatin at a concentration of 15.6 µg/ml on the percentage of viability of Sw480 cells for an exposure period of 48 hours was also studied. The other aspect of the study included calculating the gene expression of both P53 and PIK3CA genes for Sw480 cancer cells after exposure to the aqueous and alcoholic extract of Withania somnifera roots for 48 hours, as well as estimating the gene expression of P53 and PIK3CA genes for Sw480 cancer cells after Exposing them to a mixture of aqueous and alcoholic extract of Withania somnifera roots and Cisplatin for 48 hours.
The cytotoxic effect of the aqueous and ethyl alcohol extract (70%) of Withania somnifera roots was measured using six half concentrations (1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.2 µg/ml). The results showed the highest percentage of viability Inhibition Rate (IR) for Sw480 colon cancer cells when exposed to the aqueous extract Withania somnifera, which reached 24.61% at a significant level (P≤0.01) compared to the control (cells not treated with the extract) (100.00 ± 2.15). When the cells were treated with the alcoholic extract Withania somnifera, which was more effective in inhibiting the growth of cancer cells, the percentage of viability of Sw480 colon cancer cells reached (9.91 ± 0.39)% at a concentration of 1000 µg/ml, meaning that the percentage of viability reached (90.09) at a significant level (P≤0.01). Highly significant (P≤0.01) compared to other used concentrations and the control treatment (100.00 ± 2.15). When treating Sw480 cells with Cisplatin, it was observed that the drug had a significant effect on the viability of Sw480 cancer cells at all used concentrations and with an exposure period of 48 hours, with a significant difference (P ≤ 0.01). The percentage of Sw480 cell viability reached 39.16 ± 2.50% at the highest used concentration of 1000 µg/ml, while the percentage of Sw480 cell viability reached 18.24 ± 1.44% at the lowest concentration (31.25 µg/ml). There was a slight gradual difference in cell viability between the other concentrations.
The results of the molecular study, which included measuring the level of gene expression of PIK3CA in Sw480 cells when treated with the aqueous extract of Withania somnifera roots for 48 hours, showed a significant increase, with the gene expression value reaching (363.3±3.561)% at the lowest concentrations used (31.25 µg/ml) compared to 1.000±0.0% of the gene expression value of the control gene GAPDH. When measuring the gene expression level of P53 when treating Sw480 human colon cancer cells with the aqueous extract of Withania somnifera roots, it reached (98.36±0.9642)% at the concentration (31.25 µg/ml) compared to 1.000±0.0% of the gene expression value of the control gene GAPDH. When using the alcoholic extract Withania somnifera, the results indicated that the highest percentage of gene expression levels for PIK3CA in cells Sw480reached (363.3 ± 3.561)% at a concentration of (31.25 µg\ml) and at a high significance level (P≤0.0001), while the highest percentage of gene expression was recorded in the same extract for the P53 gene, which reached (1.281 ± 130.7)% at a concentration of (1000 µg/ml) at a significance level (P≤0.0001) compared to (1.000 ± 0.0)% gene expression value for the control gene GAPDH. The results of gene expression of PIK3CA when treating human colon cancer cells Sw480 with Cisplatin at a concentration of 15.6 µg/ml showed that the highest percentage of gene expression reached (100.1 ± 0.9810%), while the highest level of gene expression value for the P53 gene appeared when treating the cells with Cisplatin, which was (299.2 ± 4.400%) at a concentration of (62.5 µg/ml) and at a significant level (P ≤ 0.0001).
The results of the combined action of the aqueous extract of the roots of the Withania somnifera plant with the drug Cisplatin at a concentration of (15.6 μg/ml) revealed that the highest percentage of gene expression for PIK3CA reached (0.9313 ± 190.0)% at a concentration of (1000 μg/ml), while the combined action of the aqueous extract Withania somnifera and the drug Cisplatin gave the highest percentage of gene expression for P53 (200.9 ± 1.969)% at a concentration of (250 μg/ml). As for the results of the alcoholic extract Withania somnifera with the drug Cisplatin, the highest percentage of gene expression for PIK3CA (4.635 ± 236.4)% at a concentration of (62.5 μg/ml), while the highest percentage of gene expression for the P53 gene was (319.6 ± 6.265)% at a concentration of (250 μg/ml) at a significance level of (P ≤ 0.0001) versus (1.000 ± 0.0%), the expression value of the control gene GAPDH. From the above study, we conclude that the active compounds in the aqueous and alcoholic extracts of the roots of Withania somnifera rendered the plant significantly cytotoxic to human colon cancer cell line Sw480 cells and to the percentage of gene expression levels for both PIK3CA and P53. Furthermore, the combined action of the aqueous and alcoholic extracts of the plant with the drug Cisplatin resulted in better toxicity results for Sw480 cells, mediated by both the percentage of cell viability and the level of gene expression for PIK3CA and P53.
