University of Kerbala
اسم الباحث : فــــــاضـــــل ســــــامــي زغيــــر
اسم المشرف : ألاستاذ الدكتورة ألاستاذ المساعد الدكتور بـــــان طـــــه محمــــــــــد : ســعــــــد محمــــــد نـــــــــــــــدا
الكلمات المفتاحية : Alternaria alternata . Alternariol . السمية الوراثية
الكلية : كلية التربية للعلوم الصرفة
الاختصاص : علوم الحياة-النبات-الفطريات
سنة نشر البحث : 2015
تحميل الملف : اضغط هنا لتحميل البحث
تم توصيف عزلات الفطر Alternaria alternata التي لها القدرة على انتاج سم الالترناريول Alternariol (AOH) مظهرياً باعتماد الصفات المظهرية والمجهرية, وجزيئياً باستخدام تقنية البلمرة وتقنية تتابع الدنا DNA Sequencing, وتحديد نسبة تردد وظهور هذا الفطر خلال عملية العزل الاولي من ثمار نبات الطماطة المصابة. وتم تحديد الجين المسؤول عن انتاج سم الالترناريول AOH باستخدام بادئ متخصص .
وتضمنت الدراسة استخلاص سم AOH والكشف عنة باستخدام كروموتوغرافيا الطبقة الرقيقة(TLC) Thin Layer Chromotographyوجهاز سائل الكروموتوغرافيا عالي الكفاءة High performance liquid chromatography (HPLC). ودراسة تاثير الظروف البيئية المختلفة (درجة الحرارة, دالة الحموضة, نوع الوسط الزرعي, الضوء والظلام ) في نمو الفطرA. alternata وانتاج السم .AOH
وتم حساب الجرعة القاتلة لنصف الجماعة السكانية لسم AOH وتاثيراته الوراثية الخلوية في خلايا نقي عظم ذكور الفئران والتي شملت حساب معامل الانقسام الخلوي والانحرافات الكروموسومية ومعامل تكون الانوية الصغيرة.
اوضحت النتائج انتشار الفطر A. alternata بشكل واسع في محافظة كربلاء اذ تم الحصول على 23 عزلة انطبقت عليها الصفات المظهرية للفطر A. alternata وبنسبة تردد بلغت 38% وونسبة ظهور 21.5%. وبينت نتائج التشخيص الجزيئي نجاح زوج البادئ AAR3 ,AAF2 في تشخيص الفطر A. alternata جزيئياً باستخدام تقنية البلمرة بوزن جزيئي 340bp اما نتائج تقنيةDNA Sequencing فقد اكدت نتائج التشخيص المظهري ونجاح زوج البادئ في التشخيص الجزيئي, وباستخدام موقع الــ NCBI BLAST تبين ان جميع العزلات كانت تعود للفطر A. alternata وان هناك مجموعتين مختلفتين وقد تطابقت عزلة المجموعة الاولى من ناحية البعد الوراثي بنسبة 100% مع العزلات الصينية وبنسبة 99% مع العزلات السعودية اما عزلة المجموعة الثانية فقد تطابقت بنسبة 100% مع عزلات تركية واخرى مكسيكية. وقسمت نتائج تحليل برنامج Mega 6 هذه العزلات على مجموعتين ضمت المجموعة الاولى العزلات (24 ,22, 20, 17, 16, 15, 14, 13, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 3, 1) فيما ضمت المجموعة الثانية العزلات 23, 21, 19, 18, 12, 4) ).
ونجح الزوج البادئي لجينpksJ في الكشف عن الجين المسؤول عن انتاج سم الالترناريول على وزن جزيئي 514bp .
واضحت النتائج ان معامل سريان سمAOH بلغ 0.43 باستخدام مذيب الميثانول والطور المتحرك tuleun : athylacetate : formic acid وبنسبة 6 : 3 : 1 وقد تطابق السم المستخلص في الدراسة مع السم القياسي حسب قراءة جهاز سائل الكروموتوغرافي عالي الكفاءة HPLC.
واثرت الظروف البيئية المختلفة على نمو الفطر A. alternata وانتاجه السم AOH فقد حققت درجة الحرارة 25 مº افضل حالة نمو للفطر بلغ فيها قطر المستعمرة 8.2 سم لمدة حضن بلغت 7 ايام متفوقة معنوياً على بقية الدرجات الحرارية الاخرى 35 ,30 ,20فيما انخفض معدل النمو بارتفاع وانخفاض درجة الحرارة وصولاً الى 2.1 سم عند درجة 35 مº. وحققت الدرجة 30 مº اعلى كمية انتاج للسم بلغت 141.1 مايكروغرام/مل فيما بلغ اقل كمية انتاج 74.5 مايكروغرام/مل عند 35 مº.
وتفوق الرقم الهيدروجيني 6 معنوياً على بقية معاملاته 8, 7, 5 اذ حقق افضل حالة نمو للفطر A. alternata بلغت 8.5 سم وانخفض معدل النمو لقيم pH الاخرى وصل الى اقل معدل نمو بلغ 4.3 عند pH يساوي 8 كذلك تأثرت كمية انتاج السم بعامل الحموضة وحقق الرقم الهيدروجيني 6 اعلى كمية بلغت 116.1 مايكروغرام/مل وبفارق معنوي عن بقية المعاملات وصولاً الى اقل كمية انتاج 57.8 عند pHيساوي 8. كما واثر نوع الوسط الزرعي على نمو الفطر وانتاجه سمAOH حيث حقق وسطPSA افضل حالة نمو بلغت 8.2 سم واعلى كمية انتاج بلغت 112.8 مايكوغرام/مل وبفارق معنوي عن معاملة عن بقية الاوساط الاخرى.
وحققت معاملة الظلام تفوقاً معنوياً على معاملة الضوء لمعدل النمو اذا بلغ قطر المستعمرة 8.2 سم للظلام و6.5 سم للضوء وحققت ظروف الظلام اعلى كمية انتاج لسم AOH بلغت 182.8 مايكروغرام/مل وبفارق معنوي كبير عن معاملة الضوء التي بلغ فيها معدل الانتاج 74.5 مايكروغرام/مل.
واظهرت النتائج ان الجرعة 368 مليغرام/ كغم لسمAOH كانت الجرعة القاتلة لنصف الجماعة السكانية للفئران واثر هذا السم في مختلف المعايير الوراثية الخلوية لخلايا نقي عظم ذكور الفئران , اذ انخفض معامل الانقسام الخلوي وبفارق معنوي مع زيادة تركيز الجرعة مقارنةً بمعاملة السيطرة البالغ قيمته فيها %14.2 حيث انخفضت هذه القيمة لتصل الى %2.1 عند الجرعة 80 مليغرام/كغم. وسبب السم ظهور انواع مختلفة من الانحرافات الكروموسومية ازدادت معدلاتها وبفارق معنوي مع زيادة تركيز الجرعة اذ حققت الجرعة 80مليغرام/كغم اعلى نسبة انحرافات بلغت 3.55% مقارنة بمعاملة السيطرة%0.10 . وازداد معامل تكون الانوية الصغيرة وبفارق معنوي ايضاً لجميع المعاملات اذ بلغ مع الجرعة 80 مليغرام/كغم 16.2 مقارنة بمعاملة السيطرة البالغة 3.7.
Characterization of Alternaria alternata Isolates That Produce Alternariol in Tomato Fruits and Study Itʹs Cytotoxic Effects
Abstract
Isolates of Alternaria altenata fungi that had the potential to produce Alternariol (AOH) were morphological characterized based on morphologic, microscopic and molecular aids by PCR and DNA Sequencing technique. The frequently and the appearance percentage of this fungi through the initial isolation from infected tomato fruit were determined. The responsible gene for Alternariol production was determined by using specific primer.
The study included the extraction and detection of AOH by using thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC). The study also included the effect of different ecological conditions (i.e. temperature, pH, culture media, dark and light ) on A. alternata growth and AOH production.
The lethal dose (LD50) of AOH and its cytogenetic influences in bone marrow of mouse male which included the calculation of mitotic index ,chromosomal aberration and micronucleus formation percentage.
Results revealed a wide distributin of A. altrenata in Karbala province where 23 isolates were obtained with the phenotypic characters at frequently 38% and 21.5% appearance .
The molecular test (diagnosis) showed a success with the pair AAF2,AAR3 primer in diagnosis of A. alternata by using PCR with a molecular weith of 340bp. Results of DNA sequencing by using NCBI BLAST ensuring the results of morphological identification and the success molecular test of pair primer AAF2,AAR3 in molecular test by using NCBI BLAST loci revealing that all isolation belonging to A. alternate. There are two different clade in Karbala first one was alignment 100% with china isolate , 99% with Saudi Arabia isolate . The second one alignment 100% with Turkey and Mexico isolate. Analysis of mega 6 divided these isolates in to two group G1(1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 22, 24). G2(4, 12, 18, 19, 21, 23).
PKSJ primer succeeded in the detection the gene that responsible of AOH production by PCR at 514bp.
Results showed the Rf of AOH was 0.43 by using methanol solvent and mobile phase (tuleun : athylacetate : formic acid) 6: 3: 1. The similar To the supplied (as standard) with extracted alternariol by HPLC. Different environmental conditions affected in A. alternata growth and AOH production. 25ºC is optimum temperature for growth where the colony diameter was 8.2 cm during the incubation period ( 7 days ) comper 20, 30 and 35 ºC , while the mean of growth was increase and decrease of temperature to 2.1 cm at 35C. at 30C achieved a maximum production 141.1 mg/ml whereas, the lowest value was 74.5mg/ml at 35C
The pH 6 was significantly superior compare with 5,7 and 8 treatment , where best growth 8.5 cm ,the growth mean was decrease with other pH reaching the lowest value 4.3 at pH 8. the production AOH was also influenced by the acidity pH wasgose the highest value 116.1mg/ml, reaching the lowest 57.8mg/ml at pH 8. PSA is the best culture media for A.alternata growth and AOH production with significant differences of other media types 8.2cm diameter of colony, 112.8mg/ml for AOH production . dark is increase significant of light treatment 8.2cm colony diameter at dark wile 6.5cm at light, so increase significant AOH production 182.8mg/ml at dark and 74.5mg/ml at light.
results showed that the dose 368mg/kg of AOH was the lethal dose LD50. And this AOH affects different parameters of bone marrow. Mitotic index was decrease of the control by significant differences, 14.2% at control and 2.1% at 80mg/kg . Chromosomal aberration show with the increase AOH concentration with significant differences 3.55% at 80mg/kg of AOH while 0.10% in control. Micronucleus formation with AOH treatment differ by significant increase 16.2 at 80mg/kg and 3.7 at control.
