اسم الباحث : انتظار جبار محمد العيداني
اسم المشرف : "ا.م. د. بان موسى حسن : ا. د. احمد نجم عبد الله"
الكلمات المفتاحية :
الكلية : كلية التربية للعلوم الصرفة
الاختصاص : علوم الحياة-النبات
سنة نشر البحث : 2025
تحميل الملف : اضغط هنا لتحميل البحث
المستخلص
أجريت هذه الدراسة في مختبرات قسم علوم الحياة /كلية التربية للعلوم الصرفة / جامعة كربلاء للفترة من 12/10/2023 ولغاية 22/1/2025 . اذ تم عزل بعض الفطريات المرافقة لأنواع من الحبوب المحلية والمخزونة في بعض السايلوات في محافظة كربلاء والكشف عن قدرتها في إنتاج الافلاتوكسين B1 باستخدام كشف الامونيا وتقنية صفائح الكروماتوغرافيا الرقيقة (TLC) Thin Layer Chromatography, وقياس تركيز الافلاتوكسين B1 باستخدام تقنية HPLC)) High-Performance Liquid Chromatography تم تشخيص الفطريات المعزولة بالطريقة التقليدية كما شخصت جزيئيا” بتقنية Polymerase chain reaction (PCR) . اختيرت عزلتان كانت احداهما اكثر انتاجا” للافلاتوكسين B1 والاخرى الاقل انتاج للافلاتوكسين B1 وذلك لغرض إيجاد المقارنة بينهما عبر اجراء تقنية تفاعل البوليمرايز المتسلسل الكمي في الوقت اللحظي ( الاستنساخ العكسي ) اختبرت فعالية عزلة البكتريا Azotobacter chroococcum في تثبيط عزلات الفطريات المنتجة للافلاتوكسين B1 , تم تصنيع مستحضر حيوي من لقاح بكتريا A. chroococcum , واختبار فعالية المستحضر الحيوي في حماية حبوب الحنطة من الإصابة بالفطريات المنتجة للافلاتوكسين B1 .
اظهرت النتائج تلوث حبوب الحنطة المخزونة بالفطريات المنتجة للافلاتوكسين بأعداد مختلفة , اذ بلغ العدد الكلي للعزلات الفطرية مقدار 349 عزلة تمثلت بـتسعة انواع , وهذه الانواع تعود لخمسة اجناس من الفطريات الخيطية
تمثلت بالأجناس Aspergillius , Penicillium , Alternaria , Fusarium و Talaromyces , أما ألانواع هي A. flavus , A. niger , A.terrus , A.tubingensis, A. caespitosus , P. camemberti , Alternaria, F. equiseti و Talaromyces tiftonensi , حيث كانت عدد عزلات الفطر Aspergillus spp. هي الأكثر سيادة من بين الأنواع الفطرية المعزولة , اذ بلغت 258 عزلة . بينت نتائج التقدير الكمي بتقنية الكروماتوغرافيا السائل العالي الاداء HPLC ان عزلة الفطر A. flavus1 كانت اكثر عزلة منتجة للافلاتوكسين B1 بتركيز 215.9ppb تلاها الفطر A. niger3 بتركيز 184.9ppb , جاء بالمرتبة الثالثة الفطر A. flavus3 بتركيز162.5ppb, ثم العزلات A. flavus2 بتركيز156.9pp , P.camembeti بتركيز155.8 ppb , Alternaria alternate بتركيز145.9 ppb , ثم A. niger2 و A.tubingensis بتركيز 124.6و 114.5ppb في حين كانت نتائج التقدير الكمي للافلاتوكسين للعزلات A.terrus بتركيز 90.5ppb, A.caespitosus بتركيز 44.9 ppb , F. equiseti بتركيز 41.3ppb و Talaromyces tiftonensis بتركيز 35.61 , ppbاما اقل عزلة منتجة للافلاتوكسين B1 كانت A. niger1 بتركيز 30.5 ppb .
اكدت الدراسة تشخيص البكتريا A. chroococcum مظهريا” ومجهريا” واكد التشخيص بتقنية PCR ، عبر تحديد تتابع القواعد النايتروحينية العائدة لهذه البكتريا التي أودعت في قاعدة بيانات البنك الجيني التابعة للمركز الدولي لمعلومات التقانات الأحيائية National Center of Biotechnology Information (NCBI) , اذ حدد للبكتريا رمز تسلسليا” خاصا” بها وهو PQ516743.1 .
أثبتت الدراسة أن البكتريا A. chroococcum ذات كفاءة عالية في تثبيط النمو الشعاعي للفطريات المنتجة للافلاتوكسين B1 المعزولة والنامية على وسط PDA وخاصة عند التركيز 3 مل من المعلق البكتيري اذ بلغ قطر المستعمرة الفطرية 0.00 سم ولجميع الفطريات المنتجة للافلاتوكسين B1 , وبلغت النسبة المئوية للتثبيط ولجميع الفطريات المدروسة 100 % . في حين اظهر التركيز2 مل من المعلق البكتيري كفاءة عالية في تثبيط الفطريات المنتجة للافلاتوكسين B1 اذ بلغ قطر المستعمرة 0.00 سم للأجناسA.niger1 , A.niger2 , A.caespitosis , P.camemberti , Alternaria Alternaria و Talaromyces tiftonensis , في حين بلغت اقطار المستعمرات للأجناس A.flavus1, A.flavus2و A.flavus3 2.50 , 0.50 , 2.05 سم على التتابع, أما ألاجناس A.niger3 , A.terrus, A.tubingensis و F. equisetiبلغ اقطار مستعمراتها 3.70 , 1.25, 2.45 و 1.12 سم على التتابع .
بينت النتائج أن التركيز 1 مل من المعلق البكتيري أعطى نتائج تثبيط أقل ضد معظم الفطريات المنتجة للافلاتوكسين B1 .
بينت الدراسة ملائمة مادة كاربونات الكالسيوم CaCo3كمادة حاملة للقاح البكتريا A. chroococcum اذ التركيز العالي للخلايا البكتيرية في الغرام الواحد من هذه المادة 1012×110 وحدة تكوين مستعمرة.غرام-1 .
اثبتت الدراسة ان المستحضر الحيوي المصنع من لقاح بكترياA. chroococcum يمتلك كفاءة عالية في حماية حبوب الحنطة من الإصابة بالفطريات المنتجة للافلاتوكسين B1 وذلك من خلال التجربة الخزنية التي أستمرت لمدة ستة أشهر وباستخدام تقنية HPLC , اذ كشفت نتائج التقدير الكمي بتقنية HPLC وجود فروق معنوية بين حبوب الحنطة دون اي معاملة (Control) مع حبوب الحنطة الملوثة بلقاح العزلات الفطرية المنتجة للافلاتوكسين B1 وبين المعاملة بالمستحضر الحيوي البكتيري والملوثة باللقاح الفطري . فبلغ تركيز الافلاتوكسين الناتج من حبوب ملوثة بالفطر A.flavus1 فقط يقدربـ 168.1 PPbفي حين بلغ تركيز الافلاتوكسين الناتج من حبوب ملوثة بالفطر A.flavus1 مع اضافة المستحضر الحيوي البكتيري يقدر بـ 41.6 PPb . في حين كان تركيز الافلاتوكسين الناتج من حبوب ملوثة بالفطريات A.tubigensis , A.terrus , A.niger2 , F. equiseti و 3 A.niger فقط تقدر بـ 173.9, 132.8 , 142.9 , 166.9 و174.2PPb بالتتابع , وكان تركيز الافلاتوكسين الناتج من حبوب ملوثة بالفطريات نفسها مع اضافة المستحضر الحيوي البكتيري يقدربـ 33.6 , 27.9 , 41.0 , 27.9 و 25.6 PPb بالتتابع . بينت النتائج أن حبوب الحنطة الملوثة بلقاح العزلات الفطرية كانت منتجة للافلاتوكسين B1 وبتراكيز عالية مقارنة مع حبوب الحنطة المعاملة بالمستحضر الحيوي البكتيري والملوثة باللقاح الفطري بعد مرور ستة أشهر من الخزن. اذ كان تركيز الافلاتوكسين الناتج من حبوب الحنطة دون أي معاملة (Control) يقدربـ 4.1 PPb وكان تركيز الافلاتوكسين الناتج من حبوب الحنطة المعاملة بالمستحضر البكتيري فقط يقدر بـ0.25 PPb
Biochemical diagnostic study of aflatoxin B1-producing fungi associated with stored wheat grains
Abstract
This study was conducted in the laboratories of the Department Biology / College of Education for Pure Sciences, University of Karbala, from 10/12/2023 to 1/22/2025. Some fungi associated with local grain species stored in silos in Kerbala Governorate were isolated. Their ability to produce aflatoxin B1 was detected using ammonia detection and thin layer chromatography (TLC). Aflatoxin B1 concentrations were measured using high-performance liquid chromatography (HPLC). The isolated fungi were identified using the traditional method and molecularly using polymerase chain reaction (PCR) technology.
Two isolates were selected, one of which was more productive of aflatoxin B1 and the other less productive of aflatoxin B1, for comparison using real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR).
The effectiveness of the Azotobacter chroococcum isolate in inhibiting aflatoxin B1-producing fungal isolates was tested. A biological preparation of A. chroococcum inoculum was prepared, and the effectiveness of the biological preparation in protecting wheat grains from infection by aflatoxin B1-producing fungi was tested.
The results showed that stored wheat grains were contaminated with aflatoxin-producing fungi in varying numbers. The total number of fungal isolates reached 349, representing nine species. These species belonged to five genera of filamentous fungi: Aspergillius, Penicillium, Alternaria, Fusarium, and Talaromyces. The other species were A. flavus, A. niger, A. terrus, A. tubingensis, A. caespitosus, P. camemberti, Alternaria, F. equiseti, and Talaromyces tiftonensi. Aspergillus spp. was the most dominant fungal isolate, accounting for 258 isolates.
High-performance liquid chromatography (HPLC) quantitative estimation results showed that the A. flavus1 isolate was the highest producer of aflatoxin B1, with a concentration of 215.9 ppb. This was followed by A. niger3, with a concentration of 184.9 ppb. A. flavus3 came in third place with a concentration of 162.5 ppb. A. flavus2 was then followed by P. camembeti, with a concentration of 155.8 ppb. Alternaria alternata was then followed by A. niger2 and A. tubingensis, with concentrations of 124.6 and 114.5 ppb. The aflatoxin estimation results for the A. terrus isolates were 90.5 ppb, A. caespitosus, with a concentration of 44.9 ppb, and F. equiseti, with a concentration of 145.9 ppb. 41.3 ppb and Talaromyces tiftonensis at 35.61 ppb. The isolate with the lowest aflatoxin B1 production was A. niger1 at 30.5 ppb.
The study confirmed the diagnosis of A. chroococcum bacteria morphologically and microscopically. The diagnosis was confirmed by PCR technique, by determining the sequence of nitrogenous bases belonging to this bacteria, which was deposited in the GenBank database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI), as a special sequence code was assigned to the bacteria, which is PQ516743.1.
The study demonstrated that A. chroococcum bacteria are highly efficient in inhibiting the radial growth of isolated aflatoxin B1-producing fungi grown on PDA medium, particularly at a concentration of 3 ml of bacterial suspension. The fungal colony diameter reached 0.00 cm for all aflatoxin B1-producing fungi. The inhibition rate for all fungi studied reached 100%. While the 2 ml concentration of the bacterial suspension showed high efficiency in inhibiting fungi producing aflatoxin B1, the colony diameters reached 0.00 cm for the genera A. niger1, A. niger2, A. caespitosis, P. cammemberti, Alternaria Alternaria, and Talaromyces tiftonensis. Meanwhile, the colony diameters for the genera A. flavus1, A. flavus2, and A. flavus3 reached 2.50, 0.50, and 2.05 cm, respectively. The colony diameters for the genera A. niger3, A. terrus, A. tubingensis, and F. equiseti reached 3.70, 1.25, 2.45, and 1.12 cm, respectively.
The results showed that the 1 ml concentration of bacterial suspension gave lower inhibition results against most fungi producing aflatoxin B1.
The results showed that wheat grains contaminated with fungal isolates produced aflatoxin B1 at higher concentrations than wheat grains treated with bacterial bio-infusions and contaminated with fungal inoculum after six months of storage. The aflatoxin concentration produced by wheat grains without any treatment (control) was estimated at 4.1 PPb, while the aflatoxin concentration produced by wheat grains treated with only bacterial bio-inoculum was estimated at 0.25 PPb.
